Лаборатории

ЛАБОРАТОРИЯ ФОТОБИОЛОГИИ

Лаборатория основана в 1961

Заведующий лабораторией: Высоцкий Евгений Степанович, к.б.н.

Сотрудники лаборатории:

Основные направления НИР

• Механизмы катализа в биолюминесцентных реакциях четырех типов светящихся ор-ганизмов (бактерии, кишечнополостные, черви, светляки): общие закономерности и различия

• Разработка методических основ применения биолюминесценции в медицине, биотех-нологии, экологии и образовании.

Задачи:

1. Установление физико-химических механизмов взаимодействия токсичных соединений с биолюминесцентными системами in vivo и in vitro при воздействии фотохимических, химических и биологических ремедиационных факторов;

2. Определение структуры эндо-генного люциферина светящихся червей F. heliota и клонирование гена, кодирующего лю-циферазу F. heliota

3. Установление закономерностей функционирования биолюминесцентной системы мягкого коралла Renilla и Са2+-регулируемых фотопротеинов.

Основные результаты 2005-2009 гг.

• С разрешением 1.7 и 2.2 A определены пространственные структуры, соответственно, апоакворина и апообелина, связанные с ионами кальция. Показано, что все три Са2+-связывающие сайта, имеющие каноническую аминокислотную последовательность, способ-ны координировать ионы кальция. Предложен механизм передачи кальциевого сигнала по молекуле фотопротеина, приводящий к запуску биолюминесцентной реакции.

• С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза показано, что различие в спек-трах биолюминесценции у двух Са2+-регулируемых фотопротеинов акворина и обелина оп-ределяется одной аминокислотой, расположенной в субстрат-связывающей полости фото-протеинов. На примере активации с помощью АТФ эндогенного рецептора P2Y2 клеток ки-тайского хомячка показана применимость мутантных фотопротеинов для мониторинга внут-риклеточного кальция при их экспрессии в животных клетках.

• С разрешением 1.93 A определена кристаллическая структура Са2+-разряженного фо-топротеина обелина, связанного с продуктом биолюминесцентной реакции, целентерамидом, и ионами кальция. Предложен механизм образования первичного возбужденного состояния эмиттера в виде нейтральной формы целентерамида, объясняющий наблюдаемые спектры биолюминесценции.

• Впервые клонирована кДНК, кодирующая Са2+-регулируемый целентеразин-связывающий белок (природный субстрат люциферазы) из светящегося морского коралла Renilla muelleri. Рекомбинантный белок экспрессирован в клетках E. coli, выделен в гомоген-ном виде и охарактеризован. Впервые получены кристаллы, и с разрешением 1.72 A опреде-лена пространственная структура Са2+-регулируемого целентеразин-связывающего белка. Показано, что целентеразин-связывающий белок представляет собой компактную глобулу, образованную двумя доменами. Молекула целентеразина расположена во внутренней гидро-фобной полости белка, но, в отличие от Са2+-регулируемых фотопротеинов, доступна для растворителя. Установлено, что наряду с аминокислотами, формирующими внутреннюю полость целентеразин-связывающего белка, в непосредственном связывании целентеразина участвуют пять молекул воды через формирование водородных связей с атомами молекулы субстрата. Показано, что карбонильная группа основной цепи Phe180 образует водородную связь с N7-группой целентеразина, что стабилизирует субстрат и защищает его от самопро-извольного окисления.

• С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза аминокислот активного цен-тра Са2+-активируемого фотопротеина обелина получены мутанты W92F-H22E и Y138F, об-ладающие уникальными характеристиками свечения, высокой активностью и стабильно-стью. Разработан одновременный биолюминесцентный иммуноанализ двух антигенов – фол-ликулстимулирующего (FSH) и лютеинизирующего (LH) гормонов в сыворотке. Эффектив-ное разделение биолюминесцентных сигналов было осуществлено с помощью широкополо-стных оптических фильтров, установленных перед детектором двухканального биолюмино-метра. Без оптимизации условий чувствительность одновременного анализа составила 0,57 mIU/мл (FSH) и 1,1 mIU/мл (LH), что не уступает чувствительности специфического радио-изотопного иммуноанализа – 0,5 mIU/мл.

Законченные разработки:

1. Клонированы и охарактеризованы гены, которые кодируют люциферазу, зеленый флуоресцентный белок и Са2+-зависимый целентеразин-связывающий белок (СВР) и являются необходимыми компонентами биолюминесцентной системы мягкого коралла Renilla muelleri.

2. С разрешением 1.7 A и 1.8 A определены кристаллические струк-туры СВР, связанного с целентеразином, и CBP в апо-форме, связанной с ионами кальция.

3. С разрешением 1.93 A определена кристаллическая структура Са2+-разряженного фотопро-теина обелина, связанного с продуктом биолюминесцентной реакции, целентерамидом, и ионами кальция.

4. С разрешением 1.7 и 2.2 A определены пространственные структуры, соответственно, апоакворина и апообелина, связанные с ионами кальция.

Международные контакты 2005-2009 гг.:

• 2005 г.:

  • США – 2,

  • Германия – 1;

• 2006 г.:

  • США – 5;

• 2007 г.:

  • Китай – 2;

  • Нидерланды – 3,

  • Англия – 3,

  • США – 1,

  • Германия – 1,

  • Греция – 2,

  • Тай-вань – 1;

• 2008 г.:

  • Китай – 8;

  • Тайвань – 2;

• 2009 г.:

  • Китай – 3,

  • Германия – 1,

  • Испания – 2,

  • Бол-гария – 1.

Гранты за 2005-2009 гг.:

• РФФИ – 12;

• Программа РАН «Молекулярная и клеточная биология – 2;

• Грант CRDF – 2;

• INTAS – 1;

• Интеграционный проект СО РАН – 3;

• Госконтракт – 2;

• Лав-рентьевский грант СО РАН – 2.

Сотрудничество:

• Университет г. Вагенинген, Нидерланды;

• Университет штата Флориды, США;

• Университет штата Джорджия, США;

• Фирма «Байер AG», Германия;

• Кафедра хими-ческой энзимологии МГУ;

• Южный федеральный университет;

• Иркутский государственный университет;

• Сибирский федеральный университет.

Связь с ВУЗами:

• Кафедра химической энзимологии МГУ, Москва;

• Кафедры биофизики и квантовой электроники СибФУ;

• Дальневосточный государственный университет;

• Ростов-ский государственный университет;

• Иркутский государственный университет.

Основные публикации лаборатории за 2005-2009 гг.

• Deng L., Vysotski E.S., Markova S.V., Liu Z.J., Lee J., Rose J., Wang B.C. All three Ca2+-binding loops of photoproteins bind calcium ions: the crystal structures of calcium-loaded apo-aequorin and apo-obelin // Protein Sci. 2005. V. 14, No. 3. P. 663-675. (IF = 3.115)

• Stepanyuk G.A., Golz S., Markova S.V., Frank L.A., Lee J., Vysotski E.S. Interchange of aequorin and obelin bioluminescence color is determined by substitution of one active site resi-due of each photoprotein // FEBS Lett. 2005. V. 579, No. 5. P. 1008-1014. (IF = 3.264)

• Liu Z.-J., Stepanyuk G.A., Vysotski E.S., Lee, J., Markova S.V., Malikova N.P., and Wang, B.C. Crystal structure of obelin after Ca2+-triggered bioluminescence suggests neutral coelen-teramide as the primary excited state // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103, No. 8. P. 2570-2575. (IF = 9.380)

• Esimbekova E.N., Kratasyuk V.A., Torgashina I.G. Disk-shaped immobilized multicomponent reagent for bioluminescent analyses: Correlation between activity and composition // Enzyme and Microbial Technology. 2007. V.40. P. 343–346. (IF = 2.375)

• Kirillova T.N., Kudryasheva N.S. Effect of heavy atom in bioluminescent reactions // Anal. Bioanal. Chem. 2007. V.387, No.6. P. 2009-2016. (IF = 3.328)

• Titushin M.S., Markova S.V., Frank L.A., Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Lee J., Vysotski E.S. Coelenterazine-binding protein of Renilla muelleri: cDNA cloning, overexpression, and characterization as a substrate of luciferase // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. V.7, No.2. P.189-196. (IF = 2.144)

• Frank L.A., Borisova V.V., Markova S.V., Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Vysotski E.S. Vio-let and greenish photoprotein obelin mutants for reporter applications in dual-color assay // Anal. Bioanal. Chem. 2008. V.391, No.8. P.2891-2896. (IF = 3.328)

• Stepanyuk, G.A., Liu, Z.J., Vysotski, E.S., Lee, J., Rose, J.P., and Wang, B.C. Structure based mechanism of the Ca2+-induced release of coelenterazine from the Renilla binding protein // Proteins 2009. V.74, No.3. P.583-593. (IF = 3.419)

• Eremeeva E.V., Markova S.V., Westphal A.H., Visser A.J., van Berkel W.J., Vysotski E.S. The intrinsic fluorescence of apo-obelin and apo-aequorin and use of its quenching to characterize coelenterazine binding // FEBS Lett. 2009. V.583, No.12. P.1939-44. (IF = 3.264)

• van Oort B., Eremeeva E.V., Koehorst R.B., Laptenok S.P., van Amerongen H., van Berkel W.J., Malikova N.P., Markova S.V., Vysotski E.S., Visser A.J., Lee J. Picosecond fluorescence relaxation spectroscopy of the calcium-discharged photoproteins aequorin and obelin // Bio-chemistry 2009. V.48, No.44. P. 10486-10491. (IF = 3.379)